annexe : méthodes d'analyses

L'eau à analyser (témoin ou essai) est extraite au dichlorométhane, en deux ou trois fractions successives. Les fractions organiques sont récupérées, séchées (par passage sur sulfate d'alumine ou par congélation), puis concentrées. Le facteur de concentration ainsi réalisé doit être au moins un facteur mille par rapport à l'échantillon initial.

Les extraits concentrés sont analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse fonctionnant en impact électronique.
Pour cette analyse par chromatographie en phase gazeuse, des colonnes capillaires à phase faiblement polaire conviennent.
Les principaux pics présents dans le chromatogramme obtenu en courant ionique total sont identifiés.

Toujours basée sur le chromatogramme obtenu en courant ionique total, une estimation serai-quantitative est réalisée sur les composés organiques identifiés dans les échantillons.
Dans ce but, le système analytique est étalonné par rapport à une solution de concentration connue d'un mélange d'alcanes aliphatiques. Ces alcanes sont choisis de façon à couvrir une gamme étendue de nombre de carbone (exemple C8 à C36). L'alcane de nombre de carbone le plus élevé dans le mélange étalon doit avoir un temps de rétention au moins égal à celui du dernier pic identifié dans le chromatogramme des échantillons.
L'estimation semi-quantitative d'un composé identifié dans un échantillon se fait par rapport à l'alcane du mélange étalon de temps de rétention le plus voisin.

Méthode par chromatographie en phase gazeuse avec un détecteur à ionisation de flamme.

Méthode "d'espace de tête" dynamique ("Purge and Trap"). Méthode décrite dans "Technique de dosage des solvants non chlorés à l'état de traces dans les eaux. Application à l'étude des matériaux au contact de l'eau" : S. RAUZY et D. RAISON, Journal Français d'Hydrologie, 1988, 19, 9-16.

Composés détectés : acétone, butanone, methylisobutylcétone, acétate d'éthyle, benzène, éthylbenzène, toluène, xylène (o, m, p), etc...

Les cellules utilisées sont les cellules humaines HeLaS3 (ATCC, CCL 2.2).
Mode de conservation : après addition de DMSO (10 % v/v final) ou de glycérol ultrapur (10 % v/v final) au milieu de culture, et répartition dans des ampoules, les cellules sont conservées dans l'azote liquide.

- milieu minimum essentiel de Eagle (10 fois concentré)	100 ml
- solution de bicarbonate de sodium à 7 %	32 ml
- solution de glutamine 200mM	10 ml
- solution d'acides aminés non essentiels 100 X	10 ml
- sérum de veau fœtal	50 ml
- eau ultrapure QSP	1 050 ml

Le pH du milieu est ajusté à 7,25 à l'aide d'une solution de soude 1N stérile. Les cellules sont cultivées à 37°C en monocouche dans des flacons de 150 cm2.

- PBS solution de Dulbecco (10X) sans calcium ni magnésium 100 ml
- eau ultrapure QSP 1 000 ml

Le pH de la solution est ajusté à 7,2.
Le décollement des cellules est obtenu en utilisant une solution de versène 1 : 5 000

Les cellules sont cultivées à 37°C et maintenues sous agitation dans des flacons de type Bellco.

- milieu minimum essentiel de Eagle pour culture en suspension 10 S (GIBCO)	100 ml
- solution de bicarbonate de sodium à 7 % (GIBCO)	32 ml
- solution de glutamine 200 mM (GIBCO)	10 ml
- solution d'acides aminés non essentiels 100 X (GIBCO)	10 ml
- sérum de veau fœtal (GIBCO)	50 ml
- eau ultrapure QSP	1 050 ml

Les milieux de culture et le sérum fœtal doivent être d'une qualité au moins égale à celle des produits GIBCO. Les flacons pour culture en monocouche doivent être de qualité au moins égale à ceux de CORNING et les flacons pour culture en suspension, de qualité au moins égale à ceux de BELLCO. D'une façon générale, la verrerie doit être en pyrex, de qualité au moins égale à celle de SCHOTT.

L'eau ultrapure utilisée pour la reconstitution des milieux de culture doit être dépourvue de toute trace de matières organique et minérale. Pour cela, elle doit être de qualité au moins égale à celle obtenue à l'aide du monodistillateur à pyrolyse (pyrodistillateur PASTEUR ^R) commercialisé par BIOSYS. A défaut, l'eau de VOLVIC en bouteille de verre peut convenir, à condition qu'elle soit fraîchement embouteillée.

Les cellules HeLa S3 sont ensemencées avec du milieu MEM dans des flacons Corning 150 cm2 et incubées à 37°C jusqu'à l'obtention d'un tapis confluent. Le milieu est éliminé et le tapis cellulaire rincé 2 fois par 5 ml de PBS, puis recouvert par 1 ml de solution de versène. Les flacons sont ensuite placés à 37°C pendant 5 min., puis les cellules décollées par agitation douce. Après addition de 5 ml de milieu, les cellules sont homogénéisées par pipettages répétés, réparties dans trois flacons et additionnées de 50 ml de milieu de culture. Dans ces conditions, le tapis est confluent en 2 jours.

Les cellules de 2 boites confluentes sont versénisées et mises en culot par centrifugation à 200 g pendant 5 min. Le culot obtenu est dispersé par pipettages dans du milieu S-MEM et la quantité de cellules est ajustée de 5.105 à 6.105 cellules par ml. Dans ces conditions, le volume de suspension cellulaire obtenu est d'environ 150 ml. Les cellules sont maintenues en suspension sous agitation magnétique continue à 37°C dans des flacons avec barreau magnétique suspendu incorporé (BELLCO). Les cellules sont dénombrées et le milieu renouvelé quotidiennement. Le temps de doublement est, dans ces conditions, d'environ 19 h.
Remarque : les cellules sont, dans les deux cas, cultivées sans antibiotique.

milieu de culture 5,2 fois concentré est préparé en mélangeant successivement :

- S-MEM 10 X	100 ml
- solution de bicarbonate à 7 %	32 ml
- solution de glutamine 200 mM	10 ml
- solution d'acides aminés non essentiels 100 X	10 ml
- sérum de veau fœtal	50 ml

Le milieu de culture 1 X est reconstitué à partir des échantillons d'eau à analyser en ajoutant 1 volume de milieu concentré à 4,2 volumes d'eau à tester. Le pH du milieu est ajusté à 7,25 avec une solution de soude 1N stérile.
Le milieu témoin est reconstitué en ajoutant un volume de milieu concentré à 4,2 volumes d'eau ultra-pure.

Des cellules HeLa S3 issues d'une même culture en suspension sont réparties dans autant de tubes que d'échantillons d'eau à tester ainsi que dans un tube témoin, à raison de 6.106 cellules par tube. Après centrifugation (200 g, 5 min., 20°C) et élimination des surnageants, chaque culot est repris par 10 ml du milieu reconstitué correspondant, ce qui amène la densité cellulaire à 6.105 cellules/ml. Les agrégats cellulaires sont dispersés par pipetages rapides, puis la suspension cellulaire est incubée à 37°C sous agitation magnétique douce. Après 20 heures d'incubation, les cellules sont soumises à la mesure de la vitesse de synthèse d'ARN.
Le tube témoin est traité de façon identique, mais les cellules sont incubées avec du milieu reconstitué avec l'eau ultrapure.

La méthode utilisée est celle décrite par C. FAURIS et Coll. (1,2).^-Elle consiste à incuber des cellules dans un milieu de culture reconstitué avec l'eau à tester, puis à mesurer, après 20 heures d'incubation, la vitesse de synthèse d'ARN cellulaire. Celle-ci est déterminée en mesurant la vitesse d'incorporation d'un traceur radioactif, l'uridine tritiée, dans l'ARN cellulaire. La technique est exposée ici brièvement

Après 24 heures d'incubation, 1 ml de chaque culture est prélevé et transféré dans autant de tubes à hémolyse placés dans un bain-marie à 37°C. Au temps zéro, chaque tube reçoit 4 gCi d'uridine tritiée (40-50 Ci/mmol) et est incubé au bain-marie à 37°C.

Après une brève agitation de chacun des tubes au vortex, des prélèvements de 100 0 sont effectués toutes les 5 minutes durant 30 min. Chaque aliquote est déposé sur une feuille de papier Whatman 3MM prétraité au dodecyl sulfate de sodium (SDS) 3 % (P/V) qui permet la lyse des membranes cellulaires.

La fraction acido-soluble est éliminée par chromatographie descendante dans de l'acide trichloacétique (TCA) 5 % (P/V). Après découpage des dépôts, rinçage dans de l'alcool froid à 96 % et séchage, l'uridine incorporée est mesurée par scintillation liquide dans 5 ml de mélange scintillant liquifluor-toluène.

Par ailleurs, à la fin de chaque cinétique un prélèvement de 100 µ1 est déposé sur un disque de papier Whatmann 3 MM et séché. Cela permet de déterminer la radioactivité totale introduite dans chaque tube.

Dans ces conditions, la vitesse de synthèse d'ARN cellulaire est linéaire pendant au moins 30 min., après une phase de latence d'environ 4 min. qui représente le temps nécessaire à l'uridine pour pénétrer dans la cellule.

Pour chaque culture, la vitesse de synthèse d'ARN est déterminée en calculant la pente de la droite de régression des valeurs expérimentales obtenues pour chaque cinétique. Cette vitesse est rapportée à celle obtenue pour le témoin arbitrairement fixé à 100 %. Les résultats sont alors exprimés en pourcentage d'inhibition de synthèse.

Mesure de la cytotoxicité des eaux par inhibition de la synthèse d'ARN cellulaire mise au point d'une microméthode de mesure de la vitesse d'ARN cellulaire et domaines d'application. Dans "les tests de toxicité aigüe en milieu aquatique". Les Colloques de l'INSERM, 1981, 106, 455-463.

Rapidity of RNA synthesis in human cells. A highly sensitive parameter for water cytotoxicity evaluation.
Water Res., 1985, 19, 677-684.

La valeur sanitaire des tests de cytotoxicité.
Communication présentée à l'Académie de Médecine le 21 Octobre 1987. Bull. Acad. Natl. Med., 1987, 171, 903-911.